В наступні роки колекція поступово поповнювалася новими надходженнями. Активну участь у формуванні гербарію брав перший завідуючий музеєм, кандидат природничих наук М. Олеховський. Зокрема, в 1903 році ним проведено вивчення Струківського степу в Костянтиноградському повіті та зібрані типові представники степової флори. Меценати продовжували поповнювати фонди музею новими надходженнями. Так, у 1903 році купець Д. Зекель подарував гербарій рослин, зібраних у Німеччині, що налічував близько 300 екземплярів.

У 1910 році гербарій музею складався вже з 5 500 гербарних аркушів, в ньому було представлено 3 720 зразків близько 1 000 видів місцевої та 1 762 зразків немісцевої флори. В цей час штат музею поступово збільшується, що дає можливість вести активні збори в природі та розпочати складання тематичних каталогів. Розширюються виставочні колекції. На літні місяці музей почав запрошувати студентів-практикантів, які займалися не лише збиральницькою роботою, а й складали каталоги, систематизували гербарій і навіть виконували за завданням Губернського земства наукові дослідження. Так, у 1912 та 1914 роках флору багнищ західної частини Полтавщини досліджував студент Харківського університету В. Ніколаєв у зв’язку з проведенням на цій території меліоративних робіт. Вивченням лісової рослинності Полтавського і Миргородського повітів займався студент Харківського університету В. Стахорський у 1915 році, який зібрав гербарій із 450 видів квіткових рослин і 150 видів мохів.

Неодноразово музей звертався до ботаніків-професіоналів за допомогою у визначенні видів. Так, у 1911 році частину гербарію музею опрацював приват-доцент Харківського університету В. Талієв. Збори студента В. Ніколаєва за 1912 рік були визначені відомим ботаніком Й. Пачоським. Цікаво, що в музеї ще в 1914 році була створена колекція альгопроб (100 одиниць). Зібрав її в басейні р. Ворскли практикант В. Стахорський, а визначив професор Харківського університету В. Арнольді. Свою допомогу надавав і ботанік, професор Новоолександрійського інституту сільського господарства та лісівництва М. Цингер, який визначив гербарій, зібраний у 1914 – 1916 роках розвідувальною експедицією Полтавської Гідротехнічної частини Харківсько-Полтавського Управління Землеробства і Державного майна (збори [?] Ярмоловича, понад 500 гербарних аркушів).

У 1928 році музейний гербарій опрацював полтавський ботанік С. Іллічевський, який детально вивчав флору краю і брав участь в організації заповідної справи на Полтавщині. Проаналізувавши гербарні збори музею (в той час вони налічували 8 000 аркушів), літературні відомості, а також спираючись на особисті матеріали, С. Іллічевський склав загальний список флори Полтавської губернії (1 027 видів вищих рослин) з позначкою для кожного виду місць знаходження.

У роки тимчасової німецької окупації Полтави значна частина музейних колекцій, в тому числі й гербарію, була втрачена, можливо, згоріла під час пожежі музею. У повоєнні роки розпочалася робота по відновленню ботанічної збірки музею (збори Л. Дух і К. Родінової). Головним колектором гербарію у 1960 - 1980-х р. була науковий співробітник музею М. Літвінова. Велику допомогу по складанню наукової картотеки флори Полтавщини та поповненню фондів гербарієм надавав і к.б.н. Д. Івашин. Творча співдружність відділу природи з науковцями Міжвідомчої комплексної лабораторії наукових основ заповідної справи Мінекобезпеки та НАН України допомогла у 1990-х роках поповнити фонди новими зразками. Це тематичні гербарії рослин із перспективних та існуючих заповідних територій Полтавщини (збори д.б.н. Т. Андрієнко, О. Байрак, Н. Стецюк).

Зараз гербарій Полтавського краєзнавчого музею нараховує 9 960 гербарних аркушів і репрезентує 1 520 видів вищих судинних рослин. Найстаріші гербарні зразки колекції датовані 1849 – 1853 роками. На жаль, колектор їх невідомий. Збереглися також збори видатних ботаніків минулого: Г. Оголевця, С. Іллічевського, В. Ніколаєва, в невеликій кількості – А. Краснова. Щодо гербарію останнього, то на його етикетках відсутній час збору, інколи не вказане і місце збору, а лише на окремих аркушах є друкований напис „Flora Poltavica. Legit Krassnow” і російська та латинська назви рослини, написані від руки. У колекції є гербарні аркуші з неповною інформацією, які, вірогідно, можна було б віднести до зборів А. Краснова. Дане питання потребує подальшого вивчення.

Ботанічна колекція Полтавського краєзнавчого музею складається із систематичного гербарію „Флора Полтавщини”, згрупованого по родинах, і тематичних гербаріїв: „Червонокнижні рослини”, „Регіонально рідкісні види”, „Ефемероїди”, „Гербарій рослин із перспективних та існуючих заповідних територій”, „Дендрологічний гербарій”, „Лікарські рослини”. Гербарій розміщений за системою А. Енглера. Починаючи з 1988 року, він формується за системою А. Тахтаджяна. Всі гербарні екземпляри етикетовані, мають інвентарний номер і номер за книгою вступу. Гербарій зберігається в картонних гербарних папках у дерев’яних шафах фондового приміщення. Розміри гербарних аркушів 42 х 30 см, проте в колекції є дореволюційні збори нестандартного розміру – 34 х 23 см і 49 х 33 см. В останні роки в зв’язку з відсутністю матеріалів, необхідних для монтування гербарію, його зразки зберігаються у газетних сорочках.

Гербарій збирався різними колекторами в основному на території колишньої Полтавської губернії та сучасної Полтавської області протягом 1849 – 2009 років. Крім того, до складу ботанічної колекції увійшли рослини, зібрані на території Уральської області і повіту, Тургайської області (Актюбінський і Кустанайський повіти), Оренбурзької області і повіту, Катеринославської губернії та гербарій з неповною інформацією (відсутні деякі дані – колектор, місце збору чи дата). До останньої групи відносяться частково збори проф. А. Краснова та гербарій із Німеччини. Гербарій формується на основі зборів співробітників науково-дослідного відділу природи музею, науковців і студентів вузів – Полтавського державного педуніверситету ім. В. Г. Короленка та Полтавської державної аграрної академії. Створені каталог ситематичного гербарію, колекційні списки тематичних гербаріїв і картотека видів флори Полтавщини.

Навчальний гербарій розміщений в експозиції науково-дослідного відділу природи по темах: „Рослини, якими харчувався мамонт”, „Фенологія”, „Рослини, характерні для різних типів грунтів”, „Лишайники”, „Мохи”, „Рослини різних ценозів” „Раритетні види”, „Бур’яни”, „Устимівський дендропарк” тощо. Він нараховує близько 200 видів і є допоміжним матеріалом. Використовується під час проведення оглядових і тематичних екскурсій. Періодично проводиться його заміна відповідно до прийнятих вимог експонування гербарних матеріалів.

Іллічевський С. Гербарій Полтавського Державного Музею// Збірник, присвячений 35-річчю музею. Том І/ Під. Ред. В. Бендеровського, Я. Риженка, М. Гавриленка. – Полтава, 1928. – С. 141–226.

Ежегодник Музея Полтавского Губернского Земства. 1913 год. – Полтава: Электрич. Типо-Лит. И. Л. Фришберга, 1915. – С. 1–2, 9, 51–53.

Естественно-исторический музей Полтавского губернского земства. Описание коллекций. – Полтава: Типо-Литография М. Л. Старожицкого, 1899. – С. VI –VII доп. , 28-30.

Отчёт о Естественно-Историческом Музее Полтавского Губернского Земства за 1903 год. – Полтава: Электр. Типо-Лит. Торг. Дома „Л. Фришберг”, 1904. – С. 11, 14, 20, 23.

Отчёт о Естественно-Историческом Музее Полтавского Губернского Земства за 1906 год. – Полтава: Типо-литография Торгового Дома И. Фришберг и С. Зорохович, 1907. – С. 7, 15, 19.

Отчёт о Естественно-Историческом Музее Полтавского Губернского Земства за 1907 год. – Полтава: Типо-Литогр. Н. М. Старожицкого, 1908. – С. 7, 11.

Отчёт о естественно-историческом музее Полтавского Губернского Земства за 1908 год. – Полтава, [1909]. – С. 5-6.

Отчёт о Естественно-Историческом Музее Полтавского Губернского Земства за 1909 г. – Полтава, [1910]. – С.2-5, 8-10, 16.

Отчёт по Естественно-Историческому Музею Полтавского Губернского Земства за 1910 год. – Полтава: Электрич. Типо-Лит. И. Л. Фришберга, 1911. – С. 3, 5-8.

Отчёт по естественно-историческому музею Полтавского Губернского Земства за 1911 год. – Полтава: Электрическая Типо-Лит. И. Л. Фришберга, 1913. – С.3-6,11.

Халимон О. В. Гербарій Полтавського краєзнавчого музею// Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції спеціалістів та студентської молоді „Сучасні погляди з популяризації природничих наук”, присвячені пам’яті В. І. Вернадського. – Полтава, 1998.—С. 59-61.

Щорічник Полтавського народного природничого музею. 1916-1918. – Полтава: Тип. Д. Н. Подземського, 1919.-- № 5-6-7. – С. 5, 7-9, 13-14, 33-39.